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系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T淋巴細(xì)胞Fas抗原的表達(dá)和凋亡的研究

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【系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T淋巴細(xì)胞Fas抗原的表達(dá)和凋亡的研究】 我們利用流式細(xì)胞儀定量檢測了不同病期sle患者外周血t淋巴細(xì)胞fas抗原的表達(dá)情況，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測dna斷裂，旨在探討sle免疫發(fā)病機(jī)理 。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T淋巴細(xì)胞Fas抗原的表達(dá)和凋亡的研究

文章插圖
一、病例和方法
(一)研究對象：均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(ara)1982年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn) ?；顒悠诤头腔顒悠趕le的判斷參照鄭敏等[1]的標(biāo)準(zhǔn) 。其中活動期10例，均為女性，年齡20～46歲；非活動期10例，均為女性，年齡22～51歲；正常人10例，均為女性，年齡23～48歲，為蘇州市中心血庫健康獻(xiàn)血員 。各組年齡、性別可匹配 。
(二)檢測方法：
1.t淋巴細(xì)胞的制備：取肝素抗凝靜脈血5ml，用ficoll-hypaque分層密度梯度離心分離出單一核細(xì)胞(pbmc) 。按張工梁等[2]的方法，用尼龍棉柱分離出t淋巴細(xì)胞 。用鼠抗人cd3 mcab檢測t淋巴細(xì)胞濃度 ＞90％，用臺盼藍(lán)拒染法檢測其活力 ＞95％ 。
2.t淋巴細(xì)胞fas抗原的表達(dá)：調(diào)整t淋巴細(xì)胞濃度為5×105/ml，用染色緩沖液(pbs ph7.4，含2％滅活人ab型血清，0.1％疊氮鈉)洗3次，以阻止非特異性結(jié)合 。加入1抗鼠抗人fas mcab(購于法國immunotech公司)工作液5μl，4℃孵育30min，pbs洗3次；再加熒光2抗綿羊抗鼠ig-fitc(購于華美生物工程公司)5μl，4℃孵育30min，pbs洗3次 。每批標(biāo)本均設(shè)陰性對照，即用正常大鼠血清取代第1抗體fas mcab為陰性對照 。
3.流式細(xì)胞儀檢測t淋巴細(xì)胞fas陽性表達(dá)百分率及平均熒光強(qiáng)度(mfi)：流式細(xì)胞儀為美國coulter產(chǎn)品 。每份標(biāo)本檢測5×104個(gè)細(xì)胞，在熒光直方圖上可計(jì)算fas陽性峰的百分率及平均熒光強(qiáng)度 。
(三)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：fas陽性細(xì)胞百分率值經(jīng)平方根的反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)換后作方差分析，平均熒光強(qiáng)度采用方差分析 。
二、結(jié)果
t淋巴細(xì)胞fas抗原的表達(dá)(表1)：如表1所示，sle患者t淋巴細(xì)胞fas陽性表達(dá)百分率及平均熒光強(qiáng)度均明顯高于正常人對照組(p＜ 0.01)，且活動期明顯高于非活動期(p＜ 0.01) 。
表1　sle患者與正常人對照組t淋巴細(xì)胞fas陽性表達(dá)百分率及其平均熒光強(qiáng)度比較（±s）
組別例數(shù)fas＋百分率平均熒光強(qiáng)度正常人對照組1020.86±3.652.44±0.35非活動期sle組1037.45±5.64＊4.27±0.26＊活動期sle組1063.67±6.06＊＊6.50±0.49＊＊ 注：＊與正常人對照組比較p〈0.01；＊＊與活動期sle組比較p〈0.01
三、討論
自1989年日本yonehara等首次報(bào)道，fas能向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)凋亡信號，fas的研究已成為分子生物學(xué)和自身免疫性疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn) 。其表達(dá)產(chǎn)物為由319個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為36 000的ⅰ型跨膜蛋白，屬腫瘤壞死因子、神經(jīng)生長因子受體家族，并命名為fas抗原(cd95) 。fas是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要自身基因，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能 。
我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了各期sle患者及正常人對照組外周血t淋巴細(xì)胞fas陽性表達(dá)率 。結(jié)果表明，sle患者明顯高于正常人對照組，且活動期明顯高于非活動期，這與國外報(bào)道一致 。myster等[3]進(jìn)一步分析了sle患者t淋巴細(xì)胞fas抗原表達(dá)升高，其中近90％的fas陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)cd29抗原，提示fas表達(dá)的增強(qiáng)反映了sle患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞處于異常活化狀態(tài) 。本室近幾年研究資料表明，sle患者外周血淋巴細(xì)胞亦是異?；罨?，并與病情具有一定相關(guān)性[4]，表明sle患者體內(nèi)有免疫功能異常 。

    經(jīng)驗(yàn)總結(jié)擴(kuò)展閱讀