為了探討中藥對(duì)沙眼衣原體(ct)的體外敏感性試驗(yàn)方法，我們利用組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)測(cè)定了3種中藥合劑對(duì)41株ct臨床分離株的體外敏感性 ?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下 。
文章插圖
一、材料和方法
(一)材料：①實(shí)驗(yàn)菌株：所有菌株均采自我院性病中心非淋菌性尿道炎(ngu)患者泌尿生殖道，經(jīng)分離、純化而得 。②細(xì)胞株：mccoy細(xì)胞：由美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(atcc)提供，本室保存?zhèn)鞔?。3培養(yǎng)基的制備：參照文獻(xiàn)[1]方法，略加改進(jìn) 。
(二)藥物和方法：
1.藥物來源：根據(jù)ngu的3種病征配制3種中藥合劑，所有中藥均購自于廣州市中藥材公司 。①中藥合劑?。河牲S柏(寧夏)、山梔子(云南)、連翹(河南)、大黃(四川)等組成 。②中藥合劑ⅱ：由柴胡(寧夏)、川楝子(四川)、車前子(江西)、龍膽草(黑龍江)等組成 。③中藥合劑ⅲ：由干地黃(河南)、金櫻子(廣東)、萆解(四川)、黃柏(寧夏)等組成 。
2.藥物的配制與保存：水提法配制[2] 。中藥經(jīng)品種鑒定、粉碎、浸泡、煮沸、濃縮和過濾等過程，最后用蒸餾水調(diào)節(jié)所需濃度至1∶1(即1ml煎液相當(dāng)于1g中藥合劑)，調(diào)節(jié)ph至7.2，置－20℃，保存期3個(gè)月 。
3.沙眼衣原體的計(jì)數(shù)方法：參照wentworth[3]方法 。
4.體外試驗(yàn)[4，5]：①菌液的稀釋：將凍存的分離株用運(yùn)送培養(yǎng)基(2sp)作不同濃度的稀釋，接種，以確定能產(chǎn)生多于4.5×103包涵體形成單位(ifu)/孔的接種濃度 。②藥液工作濃度滴定：按預(yù)試驗(yàn)測(cè)定的最低抑菌濃度，以此為中間值滴定9個(gè)等比稀釋度，用時(shí)以無菌營養(yǎng)液稀釋 。③抑菌濃度的測(cè)定：在96孔板中，培養(yǎng)mccoy細(xì)胞24h，使之致密單層，按確定接種量加入待檢分離株，35℃、2 000g離心1h，繼續(xù)37℃ 5％ co2孵育1h，棄上清液，每孔加入0.1ml無抗生素含放線菌酮之營養(yǎng)液，同時(shí)加入等比稀釋之藥液0.1ml于各孔，每個(gè)滴定度設(shè)復(fù)孔，繼續(xù)37℃ 5％ co2培養(yǎng)48h，棄上清液，甲醇固定，碘染色判斷結(jié)果 。鏡下復(fù)孔均未見包涵體之最低稀釋度為mic；復(fù)孔平均包涵體細(xì)胞計(jì)數(shù)近于無藥對(duì)照的50％為mic50 。
5.殺菌濃度的測(cè)定：①最低殺菌濃度ⅰ(mbcⅰ)：按上述方法設(shè)復(fù)板，一塊染色讀取mic，另未染色板直接讀取mic孔細(xì)胞，棄上清液，用2sp洗滌2次，收集其未生長孔細(xì)胞繼續(xù)盲傳1代，48h后同前染色觀察結(jié)果；以未見包涵體的最低稀釋度孔濃度為mbcⅰ 。②最低殺菌濃度ⅱ(mbcⅱ)：按前述方法，不同的是在接種、離心、孵育24h后，加入不同稀釋度的藥液，測(cè)定得到的最低殺菌濃度為mbcⅱ 。
6.對(duì)照分組：①藥物處理組：把不同稀釋度的藥液0.1ml加入mccoy細(xì)胞中，培養(yǎng)48h，以確定藥液是否存在細(xì)胞毒作用 。②無藥(空白)對(duì)照組：加入已確定接種量的菌液，不加藥液，與試驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行 。③2sp對(duì)照組：用2sp液取代藥液，觀察2sp對(duì)沙眼衣原體生長的影響 。④蒸餾水對(duì)照組：以蒸餾水代替藥液，觀察蒸餾水對(duì)沙眼衣原體生長的影響 。
二、結(jié)果
(一)藥物對(duì)41株沙眼衣原體分離株的抑菌作用：見表1 。
表1 3種中藥合劑對(duì)41株沙眼衣原體分離株的抑制作用結(jié)果
中藥 合劑藥物濃度抑菌濃度31.2515.607.803.901.950.98范圍mic50micⅰ2（1）15（10）15（17）8（9）1（3）0（1）0.98～31.257.069.10ⅱ10（4）25（15）4（14）1（5）1（3）0（0）1.95～31.259.5715.89ⅲ10（3）27（18）3（15）0（3）1（1）0（1）0.98～31.2510.2416.43
注：表內(nèi)為抑菌數(shù)，括號(hào)內(nèi)為mic50抑菌數(shù)
(二)3種中藥合劑在不同給藥時(shí)間殺菌作用的關(guān)系：見表2 。
表2 3種中藥合劑不同給藥時(shí)間對(duì)沙眼衣原體分離株殺菌活性的比較（mg/ml）
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