近年體外研究發(fā)現(xiàn)角朊細胞(kc)能產生多種影響黑素細胞(mc)增殖、黑素形成、形態(tài)、分化及其存活的細胞因子［1］，其中以堿性成纖維細胞生長因子(bfgf)、內皮素-1(et-1)和干細胞因子(scf)最為重要 。halaban等的體外研究證實［2］，來源于kc的bfgf是正常mc的自然生長因子 。白癜風的基本病理改變是表皮內的mc減少或消失，其發(fā)生的確切原因仍不清楚 。了解kc所分泌的細胞因子bfgf在不同病期節(jié)段型白癜風皮損處kc的表達狀況，為判斷mc自體移植治療白癜風后白斑區(qū)mc的轉歸提供一定的實驗依據以及進一步認識該病的發(fā)生機制，均有一定意義 。為此，本實驗采用原位雜交的方法，在分子水平觀察了節(jié)段型白癜風皮損區(qū)kc表達細胞因子bfgf的
文章插圖
一、材料和方法
(一)病例：胸背部節(jié)段型白癜風患者17例，男11例，女6例；年齡16～38歲；病程6個月至15年，平均7.5年；其中活動期8例，穩(wěn)定期9例；取材部位為白斑與正常皮膚交界處的白斑皮膚 ?；颊叻中?、分期參照全國色素病學組修定的白癜風臨床分型及療效標準進行［3］ 。正常人對照采用胸背皮膚，共8例，男3例，女5例；年齡21～40歲 。所有標本取材后立即放入液氮凍存?zhèn)溆?。
(二)原位雜交：
1.探針的標記及原位雜交：0.8kb的bfgf cdna裸探針由美國abraham博士惠贈 。采用地高辛dna標記及檢測試劑盒標記(德國寶靈曼公司)，標記過程按試劑盒規(guī)定步驟進行；原位雜交參照文獻［4］進行 。
2.陰性對照：設置三種［4］：①以不加探針的雜交液進行雜交；②切片在雜交前用rnase處理，以降解細胞內所有的rna；③先用等量的未標記探針雜交后再用標記探針雜交 。
3.結果判斷：在排除非特異性染色的情況下，原位雜交以胞漿內出現(xiàn)淡藍色顆粒為陽性，典型的呈“月牙”狀，每張切片在400倍鏡下隨機選擇10個視野，計數(shù)每個視野中的陽性細胞，每例計數(shù)10張切片，取其平均值，作為該例標本的原位雜交陽性數(shù) 。
(三)統(tǒng)計學處理：實驗結果用t檢驗進行統(tǒng)計學分析 。
二、結果
正常人皮膚組織可見細胞內bfgf的mrna表達，其分布主要為表皮內的kc、真皮內的成纖維細胞，表皮內表達bfgf mrna的kc主要分布在基底細胞層和棘細胞層 。在皮損處，陽性細胞主要分布于棘細胞層和顆粒層，真皮內陽性細胞與正常人對照間未見顯著性差異 。各組陽性角朊細胞平均數(shù)分別是：正常人表皮13.6±5.3，穩(wěn)定期白癜風10.2±4.4，活動期6.7±3.9 。穩(wěn)定期白斑區(qū)kc的分布和其陽性細胞數(shù)與正常人皮膚間無顯著性差異，而活動期白斑區(qū)kc的陽性細胞數(shù)則低于正常人對照(p＜0.05)，陰性對照所采用的3種陰性對照方法結果均為陰性 。
三、討論
既往觀察bfgf mrna的表達多在培養(yǎng)細胞中進行，已發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的kc、成纖維細胞和內皮細胞均能表達該因子的mrna［1，5］，在組織原位中的觀察報道較少 。1991年scott等［6］報道用同位素標記bfgf的rna探針對正常皮膚進行原位雜交，首次證實了體外實驗的發(fā)現(xiàn)，即皮膚組織內kc、成纖維細胞和內皮細胞表達bfgf，他們的實驗觀察到，正常表皮內從基底層至顆粒層細胞幾乎全有密集的表達信號，各層之間的信號強弱無區(qū)別，真皮內成纖維細胞和內皮細胞的表達信號散在分布且強弱不一 。從我們的實驗結果看，正常人表皮內并非所有的細胞表達bfgf，而僅有少部分基底層和棘層細胞有表達信號；真皮內可見散在陽性細胞，從分布和形態(tài)上可以確定是成纖維細胞和內皮細胞，但陽性細胞數(shù)也遠低于scott等的報道，上述差異出現(xiàn)的原因可能與所用探針性質和雜交方法不同有關 。
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