如何獲得高質(zhì)量的生物rna ， 是分子生物學研究的基礎(chǔ)和極為關(guān)鍵的一步 。如northern印跡及雜交分析 ， 寡聚(dt)纖維素選擇分離mrna ， cdna合成及體外翻譯 ， rt-pc r等實驗的成敗 ， 很大程度上決定于rna的純度和完整性 。我們參考哺乳動物細胞rna的抽提 方法 ， 并對其作了適當?shù)男薷?nbsp;， 成功地獲得了高質(zhì)量的rna ， 同時對它們的優(yōu)劣進行了初步 的比較 。
文章插圖
一、材料和方法
(一)菌株和試劑：菌株由我院中國醫(yī)學真菌保藏管理中心隱球菌專業(yè)實驗室提供 ， 編號為cc cc0112 ， 為臨床分離株 ， 保存于沙堡固體培養(yǎng)基斜面上 。試劑有：①液體培養(yǎng)基yepd：1%酵 母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖 。②溶液d：4mol/l異硫氰酸胍、25mmol/l檸檬酸鈉(ph7.0 )、0.5% sarcosyl、0.1mol/l β-巰基乙醇組成 。③鹽酸胍勻漿1：8mmol/l鹽酸胍、0. 1mmol/l醋酸鈉(ph5.2)、5mmol/l β-巰基乙醇、0.5%十二烷基肌酸鈉(sls) 。④鹽酸胍 勻漿2：8mmol/l鹽酸胍、0.1mmol/l醋酸鈉(ph5.2)、1mmol/l β-巰基乙醇、20mmol/l e dta ph8.0 。⑤licl/尿素液：3mol/l licl、6mmol/l尿素 。⑥懸浮液：10mmol/l tris-cl ph7.0、1mmol/l edta ph8.0、0.5% sds 。
(二)方法：
1.菌株的培養(yǎng)和裂解：保藏的菌株接種到固體沙堡培養(yǎng)基斜面上 ， 活化3天后移種一整環(huán)菌 株于100ml yepd培養(yǎng)基中 ， 30℃振蕩培養(yǎng)(200r/min)過夜 ， 取1ml菌液離心收集菌體(4000r/ min 5分鐘) ， 無菌生理鹽水清洗后重新離心收集菌體(4000r/min 5分鐘) 。
2.rna的分離：方法1參見文獻［1］ 。方法2參見文獻［2］：以licl/尿素液懸浮菌體 ， 移 到組織勻漿器中 ， 電動勻漿3分鐘 ， 勻漿液4℃靜置4小時后移至eppendorf管中 ， 離心12 00 0r /min 30分鐘 ， 棄上清液 ， 加入原勻漿液1/2容積的預冷licl/尿素液振蕩充分混勻 ， 離心(12 00 0r/min 30分鐘) ， 棄上清液 ， 用1/2原勻漿液容積的懸浮液溶解沉淀物 ， 加入等容積的酚∶ 氯仿∶異戊醇(25∶24∶1) ， 反復顛倒離心管 ， 混勻10分鐘 ， 離心(3000r/min 5分鐘) ， 吸取 上 清液 ， 加入1/10體積的3mmol/l naac(ph5.2)和2倍體積乙醇 ， 混勻 ， -20℃放置15分鐘 ， 離 心沉淀rna(12 000r/min 15分鐘) ， 棄上清液 ， 75%乙醇清洗rna ， 風干后加入50μl depc處 理 過的雙蒸水 ， 溶解rna 。方法3［3］：以1ml溶液d懸浮菌體 ， 轉(zhuǎn)移 到電動勻 漿器中 ， 冰浴中勻漿3分鐘 ， 移至4ml eppendorf管中 ， 加入0.1ml 2mol/l濃度的醋酸鈉 ， p h4.0 ， 充分混勻后加入1ml的酚-氯仿 ， 反復翻轉(zhuǎn)混勻后劇烈搖蕩10秒 ， 冰浴中靜置15分鐘 ， 樣本在4℃條件下離心15分鐘(13 000r/min) ， 吸取上清液 ， 加入1ml的異丙醇 ， 混勻后-2 0℃靜置30分鐘 ， 離心沉淀rna(13 000r/min 15分鐘) ， 2倍體積的冰凍乙醇清洗后 ， 沉淀風 干 ， 以50μl depc處理過的無菌水溶解rna 。
3.rna的檢測：各取10μl rna溶液與2μl溴酚藍混勻后 ， 瓊脂糖凝膠電泳檢測rna ， 同時取4 μl rna樣品 ， 加水至1ml混勻后 ， 轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中 ， 先用1ml水校正零點 ， 2 60nm和280nm分別讀出吸光度a值 ， 檢測rna的純度和濃度 。
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